如果将下游工艺开发看成是爬山，那么阳离子层析可以算是最难跨过的山峰之一。阳离子工艺开发过程可能会遇到单抗洗脱有两个洗脱峰的情况，小编在某项目中就遇到了这一现象，进而对双峰出现的原因和解决方法进行了文献查阅和实验探索。

01 阳离子层析洗脱双峰现象

Jing Guo[1], Haibin Luo[2] 等在研究中发现，某些抗体阳离子层析工艺开发时出现洗脱峰双峰现象（图1A）[2]；将A中的两个峰分别收集、透析后重复阳离子层析过程，发现两者洗脱图谱峰形相同（图1 B）[2]，且依然呈现双洗脱峰现象，即双峰组分无明显差异；研究者进而发现，在不同上样载量条件下，洗脱图谱均为相似的双峰（图1 C）[2]。这与小编在项目推进中遇到的情况非常相似。

02 阳离子层析出现双峰原因

Haibin Luo[2] 等进一步探究了抗体阳离子层析出现双洗脱峰的原因：组氨酸存在于绝大多数抗体蛋白中，而组氨酸基团在不同pH缓冲液条件下带电情况也会不同。一个组氨酸残基的平均pKa是6.0，但组氨酸残基在疏水环境中通常具有更低pKa和较慢的质子化速率。焦碳酸二乙酯(DEPC)可特异性结合溶剂和蛋白质表面未质子化的组氨酸残基，而羟胺可以去除DEPC对组氨酸的修饰（图2A）[2]；DEPC对组氨酸的修饰过程及羟胺的去组氨酸DEPC修饰过程均不会对抗体结构产生影响，可通过质谱确定被DEPC修饰的组氨酸位点，且DEPC修饰不会对蛋白紫外吸收造成影响（图2D）[2]，即可通过组氨酸DEPC修饰/去修饰来研究组氨酸对抗体阳离子层析出现双洗脱峰的影响。如图2B、2C所示，选择不同时间/程度的组氨酸DEPC修饰及去DEPC修饰的抗体产物进行阳离子层析，可见随着组氨酸DEPC修饰时间/程度的增加，洗脱双峰现象有所变化直至消失（图C3基本呈现单洗脱峰）[2]；而随着羟胺的去组氨酸DEPC修饰时间/程度的增加，双峰现象重新出现。上述实验证明抗体序列中的组氨酸是导致抗体阳离子层析双洗脱峰的因素。

如图3A[2]显示，经质谱鉴定，1号组氨酸残基位于可变结构域，2-10号组氨酸残基位于恒定结构域（大多数单抗都有，但阳离子层析多数未表现出双峰现象）。使用F(ab’)2蛋白酶切除Fc Region后，对酶切产物F(ab’)2 进行阳离子层析纯化时，同样出现了双峰现象（图3B）。该结果表明F(ab’)2的组氨酸很有可能是导致阳离子层析双洗脱峰的因素，但是并不能确定是可变结构域的1号组氨酸还是恒定结构域的2-5号组氨酸的影响。

03 阳离子层析双峰解决策略

3.1.阳离子填料筛选

Haibin Luo[2]等发现，在相同层析洗脱条件（50mM NaAc，NaCl梯度洗脱）下，使用不同的层析填料会有不同的色谱表现：如POROS 50HS和Fractogel SO3-(M)阳离子洗脱出现两个峰，Nuvia S和Source 30S出现肩峰，而Toyopearl SP 650M为单洗脱峰（图4），即可通过填料筛选避免工艺中双峰的产生。

但是详细对比这几种填料的具体信息表1，小编发现阳离子洗脱双峰现象和填料的基质或配基没有必然的联系，应该是一种综合的影响：如Fractogel SO3-(M)和Toyoperal SP 650M的填料基质都是聚甲基丙烯酸酯，而一个洗脱有双峰另一个没有。Source 30S和Sepharose SP配基相同一个洗脱峰双峰另一个是肩峰。

3.2洗脱Buffer的选择

如上所述，小编在某抗体项目阳离子工艺开发也遇到了双峰现象，将两个峰分别收集检测后发现蛋白质量没有显著差异。因为种种原因，本项目无法更换不同基质或配基的填料，且通过改变上样及洗脱pH（图5a）、增加低盐淋洗（图5b）等均无法完全避免双峰的情况。通过进一步查阅文献，小编发现精氨酸可以改变蛋白和填料作用力，于是尝试了一下发现洗脱液中添加一定浓度的精氨酸，确实可以避免阳离子层析双洗脱峰的产生（图5c、5d）；该工艺经中试250L培养体积的下游纯化生产验证，证明工艺稳定性及可放大性良好。

关于精氨酸和抗体相互作用从而影响抗体洗脱的原理也有很多研究和报道［3］。精氨酸含有胍基团和一个两性分子，有研究者对比研究了胍和精氨酸对蛋白层析表现的影响。图6 a显示的是胍对研究蛋白在Capto MMC层析洗脱的盐浓度的影响：根据图a中黑色和灰色高度对比，可见加入0.035M 胍浓度对层析洗脱盐浓度有较大影响，部分蛋白洗脱盐浓度增加，部分蛋白洗脱盐浓度降低；b显示的精氨酸对研究蛋白在Capto MMC层析洗脱盐浓度影响：可见在加入0.035M 精氨酸后多数蛋白洗脱盐浓度显著降低，即精氨酸对洗脱盐浓度有显著影响，可以降低蛋白洗脱的盐浓度。a和b的对比说明精氨酸中的胍基对蛋白的色谱表现有一定影响，但精氨酸整体分子对蛋白洗脱的的影响作用更加具有规律性，Capto MMC层析中能够降低蛋白的洗脱盐浓度。

Siddharth Parimal,等利用分子动力学（Molecular Dynamics,MD）模拟研究胍和精氨酸与蛋白质的相互作用，图7［3］结果显示胍和精氨酸会与蛋白表面带正负电的基团同时存在相互作用，进而影响蛋白的表面电荷分布。

Siddharth Parimal还通过电荷间相互作用来分析胍和精氨酸对蛋白和填料结合的影响。精氨酸和胍都含有带正电荷的基团。胍和精氨酸分子的胍基与Capto MMC配体有静电相互作用。图8 a显示没有精氨酸和胍添加的蛋白和填料相互作用，蛋白只有带正电基团能与填料相结合；图8 b显示胍对蛋白和填料相互作用，胍带正电可以分别结合填料和蛋白的负电基团，改变填料和蛋白之间的结合位点，从而影响蛋白和填料的相互作用力。对不同性质的蛋白起到增大或减少与填料结合力的效果；图8 c显示精氨酸也可以同时结合蛋白或者填料。由于精氨酸分子比胍分子大很多，精氨酸与蛋白结合后由于空间位阻会导致蛋白无法和填料相结合，降低了蛋白和填料之间的结合力，使蛋白可以更低的盐浓度洗脱。

Siddharth Parimal用分子动力学和电荷相互作用分析精氨酸和胍会和蛋白的表面带电基团相互作用，结果表明在层析时加入精氨酸和胍会改变蛋白和填料之间的结合作用力。精氨酸由于分子较大同时带有正负电基团对蛋白结合影响更显著，可降低阳离子层析蛋白洗脱的盐浓度。

04 总结

抗体阳离子层析出现双洗脱峰，可能与抗体序列中组氨酸有关系。可以尝试通过筛选不同的填料来解决；也可尝试在洗脱液中加入精氨酸或直接精氨酸洗脱，通过改变蛋白和填料的结合力，来避免双洗脱峰的产生。

参考文献

[1]Jing G , Creasy A D , Barker G , et al. Surface induced three-peak elution behavior of a monoclonal antibody during cation exchange chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1474:85-94

[2]Luo H ,  Cao M ,  Newell K , et al. Double-peak elution profile of a monoclonal antibody in cation exchange chromatography is caused by histidine-protonation-based charge variants[J]. Journal of Chromatography A, 2015.

[3] Parimal S ,  Garde S ,  Cramer S M . Effect of guanidine and arginine on protein-ligand interactions in multimodal cation-exchange chromatography.[J]. Biotechnology Progress, 2016.

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