如果把生物药研发-生产-上市这条道路比作一场艰苦卓绝的修行，细胞株构建则是征途之始。基于“质量源于设计”的理念，我们希望在起点就筛选到一个“天资卓绝，根骨极佳”的细胞株，方方面面都符合预期标准，避免耗时费力的优化工作，使得后续的上下游工艺开发（没错，对下游工艺也很重要）、工艺放大、质量控制等环节一片通途。

在评价细胞株的各项指标中，表达量高低无疑是通常最受关注的一项。我们的细胞株平台一年要完成15~20个左右稳定细胞株项目（附表. 2020年部分稳定细胞株项目类型和表达量），项目大多为单抗和双特异性抗体，兼有少量融合蛋白。

就以上分子结构而言，使用CHO-K1细胞株构建平台，经过10-12周的细胞株构建和筛选过程，14天的CD 培养基Fed-batch培养工艺下，细胞群表达量2~6g/L，克隆表达量4~8g/L是符合预期的表达量范围。当然，极少数的特殊情况下最终的单克隆细胞株表达量低于预期，我们倾向于认为该分子相对“Difficult to Express”。从Drug Discovery阶段成百上千个候选分子中，经历一系列筛选及成药性评估后脱颖而出的一个或几个佼佼者，进入到稳定细胞株构建阶段后，为什么有的表达量高，有些表达量却还是低于我们的预期呢？ 

众所周知，外源蛋白在宿主细胞中的表达过程即为外源基因导入-转录-翻译-蛋白质折叠加工分泌的过程。然而宿主细胞是活的生命体，微米级别的小小生命体内运行着一套精巧复杂的自有法则，在大部分常规的稳定细胞株构建过程中，我们往往只能利用脂质体、电穿孔等方法进行第一步的播种，目的基因进入细胞内部后生根发芽开花结果等一系列微观过程则难以掌控。因此，在从基因到蛋白的任意一个步骤出问题，都有可能影响最终的细胞株表达量。

有研究建立了一个诊断模型来探究造成细胞株表达量低的因素，具有一定的参考价值。对于一个表达量低于预期的Mab A，可选取一个表达量正常的Mab B进行对照，利用定点整合的方法构建细胞株以最大程度地排除随机整合带来的基因水平异质性。接着进行如下研究：

01

探究表达产物对细胞是否有影响

利用四环素调控表达系统（Tet-on），在细胞群筛选过程中分为”Induced”(+Dox)和“Not Induced”（-Dox）两组，再分别进行单克隆筛选。筛选出的单克隆进行Fed-batch，比较不同条件下单克隆之间表达量、生长、Qp等方面的区别。在Dox持续存在下，表达被激活，表达产物持续积累。如若克隆在Dox是否持续存在下，表现有显著差别，则可初步判断因表达产物的毒性导致细胞株表达量低。

02

探究基因转录水平是否正常

利用qRT-PCR检测细胞株轻重链mRNA相对表达水平，与正常表达细胞株进行比较，如若结果有显著性差别，则可初步判断因转录水平不足导致细胞株表达量低。

03

探究目的蛋白的分泌情况

利用环乙酰亚胺（cycloheximide，CHX）抑制蛋白质翻译，结合Dox的作用观察目的蛋白的分泌、折叠和降解情况。在CHX和Dox共同存在的情况下，目的基因表达被激活而蛋白质合成受到抑制，利用Western Blot检测培养上清中有无目的蛋白轻重链条带。解除CHX抑制后在固定时间间隔同步检测上清中Mab A&B的轻重链表达情况，如二者有显著性差别，则表明正确折叠和组装蛋白不能正常分泌到胞外，从而影响细胞株表达量。

04

探究目的蛋白的折叠装配情况

将经CHX处理后的细胞收集裂解，提取胞内总蛋白，观察细胞内部轻重链积累情况，同时关注BiP的积累。BiP是可与不正确折叠或错误组装蛋白结合，使其停留在未折叠状态的一类分子伴侣，其积累水平可作为内质网应激状态的指征。如观察到胞内轻链或重链有相对异常积累，且BiP水平相对较高的现象，则可判断目的蛋白在胞内积累导致细胞株表达量低于预期。

在了解造成细胞株低表达的因素后，我们通过“先天”的手段，如序列优化、表达载体及宿主细胞改造等，可以一定程度上提高细胞株表达量；“后天”也能通过对细胞株“私人订制”的培养工艺在提高表达量方面取得一些成果。然而，在我们孜孜不倦地追求越来越高的细胞株表达量时，不禁引人思考：细胞株的表达量是越高越好吗？

答案无疑是否定的。表达量是评价细胞株重要却不唯一的维度，从整个项目周期来看，Final Clone的确起到了一锤定音的效果，后续的工作都必须围绕着它进行，也因此，在敲定最后的细胞株之前应当为未来环节考虑，挑选生长理想，代谢稳定，产物质量符合要求的细胞株，而不是一味追求高表达量。

此外，基于国内药品集采后的现实形势，成本控制显得尤为重要。有不少研究建立模型以研究抗体产量与生产成本之间动态变化过程。追求高表达细胞株的最现实因素莫过于后续生产的上游规模和成本，相对于高表达细胞株而言，低表达细胞株无疑使得上游成本占主导位置，因此提高表达量是优化上游生产成本的关键。有研究表明，当细胞株蛋白表达量从0.5g/L增至5g/L，单抗生产成本大幅度降低。然而对于下游而言，在同等发酵体积下，细胞株表达量的提高意味着下游填料量的增大，从而使下游成本迅速提高。

有研究表明，当细胞株表达量从2 g/L提高到10 g/L时，下游成本从总支出的48%提高到73%。另有研究指出，当表达量达到5g/L以上时，对成本影响减弱，转化为下游过程控制主导。因此，对于当下环境而言，或许更需考虑平衡上下游成本，对于细胞株的表达量，也多了一个重要的现实考虑因素。

关于细胞株表达量的二三事讨论到此就告一段落了，细胞株表达量这一简单而直观的数据背后，还蕴藏着许多值得思考和探讨的话题，文中的几个方面只是冰山一角，海面下隐藏的信息值得继续挖掘。通过以上讨论，我们能更深切地认识到，细胞株构建的工作，与其说是在花园里寻找一朵最美丽的玫瑰花，不如说是找到一朵足够美丽的——美丽，没有硬伤，这就是我们想要的，适合我们的玫瑰了。

参考文献：

1、Tadauchi T，Lam C，Liu L, et al. Utilizing a Regulated Targeted Integration Cell Line Development Approach to Systematically Investigate What Makes an Antibody Difficult to Express. Biotechnol Prog. 2019 Mar;35(2):e2772.

2、Misaghi S, Chang J, Snedecor B. It’s time to regulate: coping with product-induced nongenetic clonal instability in CHO cell lines via regulated protein expression. Biotechnol Prog. 2014;30 (6):1432–1440.

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4、Farid SS. Economic drivers and trade-offs in antibody purification processes. BioPharm International. 2009;2009(7).

5、Yang O, Qadan M, Ierapetritou M. Economic Analysis of Batch and Continuous Biopharmaceutical Antibody Production: A Review. J Pharm Innov. 2019; 14: 1–19.

6、史策，虞骥，高栋，等.《单抗制备的过程模拟和经济分析》，《化工学报》.2018(7):3198-3207.

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