中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为重组蛋白生产的重要宿主细胞之一，随着细胞系开发和培养工艺的优化，其生产水平已大幅提高。但一直以来，我们对于细胞内重组蛋白生产的分泌机制知之甚少。特别是随着新一代生物制剂的开发，复杂而难以表达的（DTE，difficult-to-express）重组蛋白数量也大大增加了。为了提高各种重组蛋白的生产，有必要了解蛋白分泌途径中可能的限速步骤。

结合本公司瞬转制备业务平台大量的抗体、融合蛋白、抗原蛋白的制备实践经验，本文探讨CHO细胞分泌途径中导致重组蛋白低效分泌和聚集的瓶颈，和当前所使用的解决策略。

1

CHO细胞内重组蛋白的分泌途径

CHO细胞内，重组蛋白的分泌起始于多肽向内质网的转移。新合成的肽链转移到内质网腔内后，进行折叠和成熟，然后通过内质网出芽，运输到高尔基体上，进行聚糖延伸或磷酸化修饰等，最后分泌到胞外（图1）。严格的质量控制机制，包括未折叠蛋白反应（UPR，unfolded protein response）和ER相关的蛋白降解（ERAD，ER-associated-protein-degradation）负责调节细胞内的蛋白稳态。

2

重组蛋白分泌途径中的潜在瓶颈

细胞内蛋白的分泌途径，每一步都受到严格的调控，以保证蛋白的正确加工和分泌。但当目标分子的转录或者翻译水平过高时，质量控制机制可能会不堪重负，导致蛋白分泌受阻。此外，与内源性蛋白相比，重组蛋白特别是非天然结构蛋白可能更为复杂，它在细胞内的正确折叠加工也更具有挑战性。

重组蛋白在分泌途径的潜在瓶颈包括新生肽链进入内质网的效率低下，信号肽的错误切割，未正确折叠导致的降解或细胞内聚集，内质网应激和应激诱导的细胞凋亡和低效的膜泡运输。多项研究报告了影响重组蛋白分泌导致蛋白聚集的因素。比如，有研究人员发现，在多肽转运到内质网的过程中，信号识别颗粒（SRP）复合物会造成信号肽的错误切割，从而导致轻链在内质网中聚集，表达量低。由于与轻链的组装效率低，导致细胞内重链聚集的现象也有所报道。而重组蛋白的胞内累积和内质网应激反应诱导蛋白（ER stress-induced proteins）水平的升高，可能暗示细胞折叠和分泌能力不足。

对这些由于分泌途径限制导致的表达量低和蛋白聚集问题，可以通过细胞工程和培养工艺的优化，提高重组蛋白表达，减少蛋白聚集。

3

解决分泌途径瓶颈的方法

3.1 基因工程

利用基因工程改善分泌途径，一是通过设计表达载体；二是调控参与目标蛋白从胞浆中的未成熟蛋白（翻译后）转变为最终形式的成熟蛋白的核心分泌机制基因的表达。现阶段的研究主要包括新生多肽向内质网的转移、内质网腔内的蛋白折叠和膜泡运输部分。

新生肽链向分泌通路的转移由信号肽引导。信号肽与胞质内的信号识别颗粒（SRP，signalrecognition particle）相互结合并识别，引导多肽链到达内质网膜，穿过易位子（Translocon）形成的通道进入内质网腔，随即信号肽被信号肽酶水解。对于不同的目的蛋白，选择合适的信号肽，对改善多肽的转移、提高表达量和阻止肽链的错误剪切有着非常重要的作用。有研究发现，通过与SRP和易位子亚基共表达，可以促进某些难以表达（DTE，difficult-to-express）蛋白的正确加工，提高表达减少蛋白聚集。

内质网是细胞内重要的蛋白质合成加工场所。多肽进入内质网后，内质网腔内有大量可溶性的驻留分子伴侣和折叠酶，如蛋白二硫键异构酶（PDI，protein disulphide isomerase）、BIP、钙联蛋白等，辅助和监控多肽的正确折叠和装配。在某些情况下，比如信号肽剪切错误时，蛋白质的折叠受到影响，导致大量未折叠或错误折叠的蛋白质堆积于内质网，由此引发一系列分子伴侣和折叠酶表达上调为标志的应答反应，称为未折叠蛋白反应（UPR，unfolded protein response）。这种现象被称为内质网应激（ER Stress）。细胞内UPR信号通路的调节元件有XBP-1，ATF4，ATF6等，在发生UPR时，诱导内质网伴侣分子和折叠酶表达，提高细胞处理未折叠蛋白的能力。值得注意的是，如果高水平的内质网应激条件持续存在，最终会导致细胞的凋亡。

目前为止，有许多研究者针对这些参与内质网上蛋白加工的基因进行了一系列实验，以评估其对细胞分泌的影响。多数研究表明这些基因的调控对重组蛋白的生产具有积极作用，但一些研究则报道了相反的观察结果（见表1）。还有研究者将目光转向了内质网分子伴侣保留机制。可溶性内质网分子伴侣在细胞器中的定位是由C端KDEL基序介导的，该基序被KDEL受体识别。KDEL受体（KDELR，KDEL receptor）是一个七层跨膜蛋白，在内质网和顺式高尔基体之间循环，以pH依赖性方式从内质网后腔室捕获错误分选的分子伴侣。研究表明，在CHO细胞过表达KDELR1，可以提高特别是生产后期的重组蛋白表达。

蛋白在内质网正确折叠组装后，通过膜泡运输到高尔基体上，经过进一步加工形成成熟蛋白，再经过高尔基体小泡运输分泌到胞外。膜泡运输是真核细胞内蛋白在内膜系统各细胞器转运的主要方式，主要包括运输囊泡的出芽、转运、拴留、锚定和膜融合过程。整个过程受到许多因子的调控，如Coat、SM、Tether、SNARE和Rab蛋白等。已有研究表明，无论是过表达促进膜泡运输的基因或敲除负调控膜泡运输的基因，对重组蛋白的表达都显示了积极影响。

除了上述常用基因工程，最近，microRNA（miRNA）分子也被研究用于改善重组蛋白生产的分泌途径。miRNA是一类小的非编码RNA，通常由~22个核苷酸组成，参与mRNA的表达调控。与传统的基因工程相比，miRNA的优势在于可以同时靶向调控多个基因和通路，提高了基因工程的控制范围。比如，在CHO细胞内表达mitosRNA-1987，抗体的表达量提高了~60%，这可能是由于mitosRNA-1987同时下调了CerS2和Tbc1D20基因的表达。但同时，由于miRNA靶标众多，在靶向我们希望的目标基因时，也可能调控了我们不希望被改变的基因表型。因此，鉴定miRNA的结合靶标并了解其功能，有助于miRNA在细胞基因工程中的应用。

3.2 培养基和工艺优化

细胞在生物反应器中容易受培养环境的影响，包括pH，温度，渗透压和溶氧浓度。优化工艺条件可以有效的提高重组蛋白表达量，缓解蛋白聚集。研究表明，pH和温度的降低，渗透压的增加，高溶氧浓度都对表达量和聚集体的减少显示出积极作用。

此外，还研究了培养基补充剂对提高蛋白表达，缓解聚集的作用。研究表明，改变培养基组成（硫酸铜和半胱氨酸水平）包括小分子化学伴侣如甘油等可以减少聚集。表明活性剂如吐温80和海藻糖也可以阻止聚合。此外，将工艺参数优化和培养基/补料补充剂添加相结合，在提高蛋白表达，减少聚集展示了良好的前景。

最近的蛋白质组学研究揭示了培养工艺和培养基补充剂对分泌途径的影响。比如，当培养温度从37℃降到33℃时，多个内质网驻留伴侣表达水平差异高达6.7倍。丁酸钠和丙戊酸通常被认为是脱乙酰化酶抑制剂，促进有效转录，提高蛋白表达。然而最近的研究发现，它们还可以正调控内质网驻留伴侣和UPR信号通路元件。

在实际应用中，还可以将基因工程和工艺工程系统地联合起来，以进一步提高重组蛋白生产。例如，在DTE Fc融合蛋白，Sp35Fc的瞬时表达中，以适当比例共转染内质网驻留伴侣CypB，并在转染后加入0.5mM PBA和1%(v/v)的甘油，可以在12天的培养中使细胞表达量显著提高6倍，并且无二硫键结合的蛋白聚集。

4

其他

目前解决重组蛋白分泌和聚集的方法仍然基于反复不断的实验探索。更全面的了解CHO细胞中复杂的分泌和折叠途径，将有助于指出合理优化的方向。测序技术和多组学工作的最新进展使我们能够全面系统的了解细胞机制及其与细胞系和细胞培养工艺的联系。一些研究已经将组学数据应用于培养基组成或基因工程，以此进行细胞系性能优化。另一方面，基因编辑工具的进步，也为分泌途径中潜在细胞靶点的验证提供了强大的技术支持。

引用文献：

1. Yizhou Zhou, Ravali Raju, Christina Alves, et al. Debottlenecking protein secretion and reducing protein aggregation in the cellular host[J].Current Opinion in Biotechnology 2018, 53:151–157.

2. Henning Gram Hansen, Nuša Pristovšek, Helene Faustrup Kildegaard,et al. Improving the secretory capacity of Chinese hamster ovary cells by ectopic expression of effector genes: Lessons learned and future directions[J]. Biotechnology Advances 2017, 35(1):64-76.

3. Yusuf B. Johari,1 Scott D. Estes,2 Christina S. Alves, et al. Integrated Cell and Process Engineering for Improved Transient Production of a “Difficult-to-Express” Fusion Protein by CHO Cells[J]. Biotechnology. Bioengineering. 2015, 112 : 2527–2542.

4. Jahir M. Gutierrez, Amir Feizi, Shangzhong Li, et al. Genome-scale reconstructions of the mammalian secretory pathway predict metabolic costs and limitations of protein secretion [J]. Nature Communication. 2020, 11(1):68.

5. Andrew Samy, Kohei Kaneyoshi, and Takeshi Omasa. Improvement of Intracellular Traffic System by Overexpression of KDEL Receptor 1 in Antibody-Producing CHO Cells [J]. Biotechnology Journal. 2020,15(6).